Các bệnh di truyền vẫn là một thách thức toàn cầu vì chúng gây ra bởi đột biến gen ảnh hưởng đến chức năng sinh học, quá trình trao đổi chất hoặc sản xuất một số protein thiết yếu của cá nhân, dẫn đến các rối loạn di truyền khác nhau. Thuốc trị liệu gen là một loại can thiệp trị liệu nhắm vào các gen cụ thể, nhằm mục đích sửa chữa hoặc sửa đổi chúng và cung cấp hướng dẫn mới cho tế bào để tạo ra protein chức năng hoặc can thiệp vào các khiếm khuyết gen gây bệnh.
Các loại thuốc gen phổ biến chủ yếu bao gồm DNA và RNA, trong đó DNA có thể là các đoạn gen hoặc chuỗi gen có tác dụng chữa bệnh. Những DNA này được chuyển đến các tế bào để thay thế hoặc bổ sung các chức năng gen bị khiếm khuyết hoặc bị thiếu. RNA có thể là RNA thông tin (mRNA), RNA can thiệp nhỏ (siRNA) hoặc oligonucleotide antisense (ASO), v.v., có thể được sử dụng để sửa đổi, ức chế sự biểu hiện của gen có hại hoặc khôi phục chức năng của các gen cụ thể.
Tuy nhiên, cả DNA và RNA đều phải đối mặt với nhiều thách thức từ việc xâm nhập vào cơ thể con người cho đến tiếp cận các tế bào đích. Do trình tự gen không ổn định trong đường tiêu hóa nên chúng thường được tiêm tĩnh mạch hoặc tiêm dưới da, nhưng ngay cả như vậy, hầu hết các trình tự gen vẫn bị suy giảm do lượng nuclease dồi dào trong cơ thể con người.
Khi một lượng nhỏ thuốc gen còn sót lại đi ra bên ngoài tế bào đích thì chúng không thể xâm nhập vào tế bào vì trình tự gen là những phân tử lớn có nhóm photphat mang điện tích âm, trong khi màng tế bào cũng mang điện tích âm. Khi hai điện tích âm gặp nhau, gen sẽ bị đẩy lùi và không thể xâm nhập vào tế bào. Do đó, chúng ta cần phát triển các phương pháp phân phối thuốc gen cụ thể để ngăn chặn sự thoái hóa của chúng trong cơ thể và cải thiện hiệu quả thâm nhập màng tế bào, đồng thời cung cấp chuỗi DNA hoặc RNA đến tế bào một cách suôn sẻ.
Phương pháp phân phối thuốc gen
Các phương pháp phân phối gen phổ biến hiện nay chủ yếu được chia thành hai loại: phân phối vectơ vi rút và phân phối vectơ không{0}}vi rút. Việc phân phối vectơ vi rút chủ yếu bao gồm vi rút liên quan đến adeno-(AAV) và lentachus, v.v., có thể mô phỏng quá trình lây nhiễm vi rút vào tế bào chủ và dễ dàng vượt qua các rào cản tế bào, do đó đạt được hiệu quả phân phối cao. Tuy nhiên, việc phân phối vectơ virus cũng có vấn đề: thứ nhất, nó có khả năng đóng gói hạn chế, chẳng hạn như khả năng đóng gói tối đa của AAV là 4,7kb, không thể phân phối các chuỗi gen dài hơn; thứ hai, vectơ virus có thể gây ra các phản ứng miễn dịch nghiêm trọng, bao gồm miễn dịch tế bào và miễn dịch dịch thể, gây ra rủi ro cho các ứng dụng lâm sàng. So với điều đó, vectơ không-vi rút có lợi thế rất lớn về độ an toàn và khả năng nạp thuốc.
Các vectơ không phải vi-rút được sử dụng phổ biến hiện nay{0}}chủ yếu bao gồm liposome, polyme, hạt nano, exosome, v.v., trong đó liposome là các túi được hình thành bởi các phân tử lưỡng tính có đường kính từ 100nm đến 1um. Chúng chủ yếu bao gồm phospholipid, cholesterol, lipid PEG và lipid cation. Cấu trúc lớp kép phospholipid tương tự như màng tế bào và có thể xâm nhập vào tế bào một cách trơn tru thông qua quá trình nhập bào. Ngoài ra, liposome cũng có thể sửa đổi PEG hoặc các kháng thể cụ thể trên bề mặt của chúng để thoát khỏi sự thanh thải miễn dịch của cơ thể trong khi nhắm mục tiêu vào các mô hoặc tế bào cụ thể. Liposome cation là liposome chứa lipid muối amoni bậc bốn tích điện dương, có thể liên kết tốt hơn với thuốc axit nucleic tích điện âm và duy trì sự ổn định của hệ thống phân phối. Do đó, liposome là một trong những phương pháp phân phối vectơ phi vi-rút phổ biến cho thuốc gen.
Tuy nhiên, liposome truyền thống cũng có một số vấn đề: trước hết là do đường kính liposome có khoảng cách lớn, mặc dù điều này có thể đảm bảo đủ khả năng tải thuốc nhưng khi liposome đi qua khoảng trống nội mô mạch máu (100{2}}200nm), kích thước quá lớn sẽ cản trở quá trình này. Ngoài ra, sau khi liposome xâm nhập vào tế bào thông qua quá trình nội bào và hình thành hệ thống nội bào-lysosome, các liposome truyền thống không thể thoát khỏi lysosomal kịp thời, dẫn đến hầu hết các loại thuốc gen bị lysosome phân hủy và không thể phát huy tác dụng của chúng. Dựa trên những thiếu sót của liposome truyền thống trong việc cung cấp thuốc gen, các hạt nano lipid (LNP) đã được phát triển và trở thành một phương pháp phân phối quan trọng, đặc biệt phù hợp để đưa axit nucleic đến các tế bào và mô đích.
Giới thiệu về Hệ thống nhà cung cấp dịch vụ LNP
Các hạt nano lipid (LNP) là các hạt nano bao gồm các chất{{0} giống lipid và đường kính thường nằm trong khoảng 10-200nm. So với liposome truyền thống, chúng nhỏ hơn và dễ dàng đi qua các khoảng trống nội mô mạch máu hơn. Ngoài ra, LNP thường bao gồm lipid cation/ion hóa, phospholipid phụ, lipid polyethylene glycol (PEG) và cholesterol. Trong số đó, phospholipid phụ và cholesterol có thể làm tăng tính ổn định của LNP; Lipid PEG giúp tăng thời gian lưu thông của LNP in vivo và giảm phản ứng miễn dịch. Những thành phần này có chức năng tương tự như liposome truyền thống. Sự khác biệt nằm ở lipid cation/ion hóa, đây cũng là lĩnh vực bảo hộ sáng chế chính của LNP.
Như đã đề cập trước đó, liposome cation có thể duy trì liên kết với thuốc axit nucleic một cách hiệu quả và cải thiện hiệu quả phân phối thuốc axit nucleic. Tuy nhiên, liposome cation cũng có xu hướng liên kết không đặc hiệu với protein huyết tương, tế bào máu, v.v. mang điện tích âm trong huyết tương, v.v. trong tuần hoàn cơ thể, gây ra sự kết tụ liposome và nhanh chóng bị đào thải ra khỏi cơ thể (thời gian bán hủy-của liposome cation trong cơ thể chỉ là 15 phút).
Để giải quyết vấn đề này, các nhà nghiên cứu đã phát triển một loại vật liệu lipid mới gọi là lipid có thể ion hóa. Lipit có thể ion hóa rất giống với lipid cation về cấu trúc. Lấy DOTAP lipid cation thông thường và DODAP lipid ion hóa làm ví dụ, sự khác biệt là DOTAP là muối amoni bậc bốn có điện tích dương, trong khi DODAP là cấu trúc amin bậc ba. Cấu trúc amin bậc ba có thể giữ pKa của lipid trong khoảng 6-7. Khi độ pH thấp hơn pKa (trong điều kiện axit), lipid có thể ion hóa sẽ tích điện dương.
Khi pH gần bằng pKa (trong điều kiện trung tính), lipid có thể ion hóa sẽ ở trạng thái trung tính. Thiết kế này có thể giải quyết một cách khéo léo vấn đề mà liposome cation gặp phải: vì độ pH trong tuần hoàn máu gần với mức trung tính nên lipid có thể ion hóa cũng trung tính và liên kết không-đặc hiệu giữa chúng với protein huyết tương hoặc tế bào máu giảm đáng kể, kéo dài thời gian bán hủy. Ngoài ra, khi LNP lipid có thể ion hóa được tế bào hấp thụ và đi vào lysosome, lipid sẽ bị ion hóa và tích điện dương trong môi trường lysosomal với pH 5{5}}6. Các lipid tích điện dương dễ dàng kết hợp với màng nội bào-lysosome, cho phép các liposome thoát ra tế bào chất, phân ly và giải phóng axit nucleic, do đó phát huy tác dụng của chúng. Tóm lại, thiết kế hệ thống chất mang LNP liên quan đến việc tối ưu hóa thành phần lipid, kích thước hạt, điện tích bề mặt và độ ổn định để đạt được khả năng phân phối gen hiệu quả.
Chiến lược phân tích sinh học LCMS cho thuốc gen đóng gói-LNP
Thuốc gen đóng gói LNP-chủ yếu bao gồm vỏ LNP và thuốc gen. Vỏ LNP chủ yếu bao gồm các thành phần lipid (lipid cation/ion hóa chiếm khoảng 30-50%, lipid PEG chiếm khoảng 2%, cholesterol chiếm khoảng 20-50%, phospholipid phụ chiếm khoảng 10-20%), trong khi thuốc gen chủ yếu bao gồm các đoạn trình tự gen (DNA, ASO, siRNA và miRNA, v.v.). Theo các quy định mới nhất của NMPA và FDA [14-15], để ứng dụng IND cho các loại thuốc thuộc hệ thống phân phối thuốc như LNP, ngoài việc tiến hành các nghiên cứu dược lý và dược động học về thành phần hoạt chất (trình tự gen), cũng cần phải đánh giá tính an toàn và dược phẩm đối với các thành phần lipid mới chưa được sử dụng trong các loại thuốc bán trên thị trường trong hệ thống phân phối thuốc, chẳng hạn như lipid cation/ion hóa và lipid PEG với những biến đổi đặc biệt trong LNP.
Phân tích sinh học LCMS của lipid LNP tập trung vào lipid cation/ion hóa và lipid PEG. Do sự khác biệt về cấu trúc giữa chúng, trọng lượng phân tử lipid cation/ion hóa thường nằm trong khoảng 1 kDa, trong khi trọng lượng phân tử lipid PEG có thể đạt 2 ~ 5 kDa sau khi mang các nhóm sửa đổi, dẫn đến sự khác biệt lớn về khả năng lưu giữ sắc ký và phản ứng khối phổ giữa chúng. Cho rằng hàm lượng lipid cation/ion hóa trong LNP cao hơn lipid PEG nên sự khác biệt về phản ứng dẫn đến không thể thống nhất hiệu quả các phương pháp tiền xử lý (lựa chọn dung môi chiết, xác định hệ số pha loãng) của cả hai. Ngoài ra, do có nhiều đỉnh giao thoa xung quanh vị trí đỉnh của lipid PEG, nên thường cần gradient tách pha lỏng dài hơn để tách hiệu quả, điều này không thể đảm bảo hiệu quả phân tích cao. Do đó, chúng tôi thiết lập riêng phương pháp phát hiện lipid PEG trong phân tích sinh học. Đồng thời, lipid cation/ion hóa và lipid PEG cũng gặp những khó khăn chung trong quá trình phát triển phương pháp do thành phần lipid của chúng như độ hòa tan kém trong nước, tính không ổn định trong nền sinh học, khả năng liên kết với protein để thu hồi vượt quá giới hạn, độ nhiễu và dư lượng lipid PEG cao, sự thay đổi độ ổn định của lipid trong nền mẫu thực và khó khăn trong việc lựa chọn nội chuẩn.
